CCK-8法進行細胞毒性檢測的方法

CCK-8法是細胞活力和細胞毒性檢測常用的一種檢測方法，其具體操作方法如下：
1.制備細胞懸液：選取生長狀態(tài)良好的對數生長期細胞制作細胞懸液，并計數。
2.在96孔板中接種細胞懸液 (100 μL/孔)。
3.將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)（37℃，5% CO2）12-24小時，使細胞達到指數期（培養(yǎng)時間根據細胞種類的不同和每孔內細胞數量的多少而異）。
4.吸出各孔培養(yǎng)基，向培養(yǎng)板加入10μL不同濃度的待測藥物進行干預。（實驗組加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)基，空白組加入不含藥物培養(yǎng)基）
5.將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）培養(yǎng)一段適當的時間（例如：6、12、24或48小時，具體時間一般根據細胞周期來決定）。
6.每孔加入10ul CCK-8試劑。①在做加藥實驗時，還應考慮藥物的吸收。如果實驗中待測物質有氧化還原劑，在不含細胞的培養(yǎng)基中加入藥物，然后加入CCK-8試劑在一定時間內檢測，和不加藥物的培養(yǎng)基進行比較（只加CCK-8試劑），如果OD值明顯偏高，則說明有反應。
②可在加CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物對實驗的影響。
③當然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。5.將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)1-4小時：
6.使用酶標儀檢測450nm波長的吸光度（OD值）按公式計算：
細胞活力（%）=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%
細胞抑制率（%）=[(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100%
As: 實驗組吸光度 (含細胞、培養(yǎng)基、CCK-8 溶液和藥物溶液)；
Ac: 對照組吸光度 (含細胞、培養(yǎng)基、CCK-8 溶液，不含藥物)；
Ab: 空白組吸光度 (含培養(yǎng)基、CCK-8 溶液，不含細胞、藥物)。

 
CCK-8法進行細胞活力指細胞增殖活力或細胞毒性檢測時的注意事項：
 
由于CCK-8是通過和細胞內的脫氫酶進行反應間接反映活細胞數量，如果細胞已經死亡，但脫氫酶的活性還在，則試劑測定的細胞數量將會比真實值高，不能真實反映活細胞數量，建議采用別的方法測定。
 
由于 CCK-8 分析基于活細胞中脫氫酶活性的檢測，因此影響活細胞中脫氫酶活性的條件或化學物質可能會導致實際活細胞數與使用 CCK-8 分析確定的細胞數之間存在差異。
 
考慮到不同類型細胞代謝水平存在差異，有些細胞在藥物處理后，可能活細胞數不變，但是有氧代謝能力降低后，NAD+產生減少，測出的Formazan也會減少。
 
CCK8可以檢測大腸桿菌，但不能檢測酵母細胞。
 
在細胞增殖實驗每次測定的過程中需要避免細菌污染，以免影響結果。
 
金屬對CCK-8顯色有影響：當終濃度為1mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應，使靈敏度降級。如果終濃度是10 mM的話，將會*抑制。
 
CCK-8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養(yǎng)基顏色接近，不注意的話容易產生漏加或多加。酚紅和血清對CCK-8法的檢測不會造成干擾，可以通過減去空白孔中本底的吸光度而消除。
 
混合或重懸組分時，避免產生氣泡，因為它們會影響OD值讀取。
 
剛開始做實驗時，建議先做幾個孔摸索接種細胞的數量和加入CCK-8試劑后的培養(yǎng)時間。
 
CCK-8反復凍融會增加背景值，干擾實驗測定。
CCK8的說明書大家一定要認真閱讀，里面很多細節(jié)的問題都有提到。而且說明書里提供的一些關于各種細胞的種板數都很有參考價值，因為那是反復驗證過的最佳數值。
CCK-8法進行細胞毒性檢測的優(yōu)勢：

1、使用方便，CCK-8細胞活性檢測試劑中為1瓶溶液，可以直接加入到細胞樣品中（懸浮和貼壁細胞均適用），不需要預配各種成分，不需要對細胞進行過多的處理，也不必添加放射性同位素、有機溶劑等，且能夠快速進行檢測；
2、CCK-8法的檢測靈敏度很高，甚至可以測定較低細胞密度；
3、CCK-8法的重復性優(yōu)于MTT 法，MTT 實驗生成的formazan 不是水溶性的，需要使用DMSO 等有機溶劑溶解；
4、而本方法產生的formazan 是水溶性的，不僅省去了溶解步驟，更因此而減少了該操作步驟帶來的誤差；
5、CCK-8法對細胞毒性小，可以多次測定選取最佳測定時間，與MTT 方法相比線性范圍更寬，靈敏度更高；
6、CCK-8 對細胞的毒性非常低，其他的實驗，例如中性紅法或結晶紫法 ，也可在 CCK-8 法檢測完后繼續(xù)進行。
     蘇州阿爾法生物提供的酶標儀、移液槍、Co2培養(yǎng)箱、顯微鏡、細胞計數儀等實驗室設備和酶標板、96孔板、離心管、PCR八聯排管、移液槍吸頭等實驗耗材以及CCK-8試劑盒、PBS緩沖液、培養(yǎng)基等生物試劑用于CCK-8細胞毒性和細胞活力檢測。