Western Blot實驗步驟

更新時間：2022-03-31

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本文摘要
蛋白質印跡技術（免疫印跡實驗）又稱為Western Blot。它是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。Western Blot主要用于檢測或分析蛋白，應用領域集中在基因表達研究、抗體活性檢測和疾病診斷等。
01 蛋白質印跡基本流程圖

02 western blot步驟
樣品準備：

Tanon 連續梯度預制膠（4-20% 10 孔/15 孔/17 孔）；（4-12% 10 孔/15 孔/17 孔）
Tanon Mops/MES 電泳緩沖液（粉劑）
Tanon 預染蛋白 Marker
Tanon 4×LDS Loading Buffer
Tanon 快速蛋白染液
預制膠規格的選擇

在不使用預制膠的情況下，需要自行配置適合蛋白電泳SDS膠，采取自制膠的方法從加入緩沖液到制膠完成這一過程大概需要花費將近1個小時。并且由于配比過程中的認為誤差容易產生濃度不均一，穩定性差，已出現外八型、笑臉型等條帶。采用天能系列預制膠具有較高的穩定性和均一性，使蛋白電泳條帶更清晰銳利，使得條帶更加均勻。還有重要的一點就是可以免去制膠的時間，大大提升了實驗效率。
蛋白轉印使用天能VE-586轉移電泳槽主要優勢在于:它可以在不埋冰的情況完成的蛋白電泳，如果配合快速轉膜液，整個電泳過程只需不到30分鐘，可同時轉印4塊膠，操作方法也比較簡便。在縮短轉印時間的同時，實現了蛋白樣品的高效轉印。

蛋白電泳
目前常用的是SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳），蛋白質會根據分子量大小分開，分子量的蛋白會留在膠的下部，分子量大的會在膠的頂部。

04轉膜
轉膜主要是將蛋白質從凝膠轉移到膜上，常用的是NC膜和PVDF（聚偏氟乙烯），由于膜與蛋白質高度親和的能力，所以更容易與蛋白結合。為了便于觀察電泳效果和轉膜效果，可以使用蛋白預染Marker，以方便判斷蛋白分子量大小。
蛋白預染的傳統方法是膜將置于脫色搖床上，用1×麗春紅染液振蕩預染5min。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。
蛋白轉印使用天能VE-586轉移電泳槽主要優勢在于:它可以在不埋冰的情況完成的蛋白電泳，如果配合快速轉膜液，整個電泳過程只需不到30分鐘，可同時轉印4塊膠，操作方法也比較簡便。在縮短轉印時間的同時，實現了蛋白樣品的高效轉印。

05封閉
轉印完成后，為阻止抗體的非特異性結合，需要用脫脂牛奶或者牛血清蛋白（BSA）作為緩沖液來填充封閉空白結合位點。
加入二抗稀釋液（一般1:1000甚至1:10000用TBST稀釋），放在搖床上，室溫下孵育1h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，即可進行化學發光反應。
注意：二抗孵育之后也要注意充分洗滌，一般30min左右為宜，如果洗膜不夠充分，顯影時會造成雜色背景。

06 ECL化學發光反應：
在工作臺上鋪一張保鮮膜，將PVDF膜置于保鮮膜上。將ECL的A和B兩種試劑在EP管內等體積混合（注意吸完A試劑后吸B試劑前要更換槍頭），然后均勻滴在PVDF膜的蛋白面，反應1~2min后，將PVDF膜上多余的ECL發光液吸干，進行固定。

07凝膠圖象分析
將膠片進行掃描或拍照，使用凝膠成像儀進行成像分析。常用的凝膠成像儀有天能系列的T4600，T5200等系列。